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    • 人分化抑制蛋白1慢病毒干擾載體的構建、篩選及其沉默效應的鑒定

      目的探索以小干擾RNA(siRNA)慢病毒干擾載體組建的慢病毒對人HepG2細胞分化抑制蛋白1(Id1)基因的沉默效應。 方法構建4種針對Id1基因不同干擾靶點的Id1-siRNA慢病毒干擾載體(pCGSIL-GFP-Id1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4),將其轉染至293T細胞,以篩選出針對Id1基因的最有效的RNA干擾(RNAi)靶序列。再以沉默效果最優的干擾載體進一步構建慢病毒(Id1-RNAi-LV),感染人HepG2細胞后,采用實時定量PCR法和Western blot法分別檢測其Id1 mRNA及其蛋白的表達水平。 結果與pCGSIL-GFP-Id1-1組、pCGSIL-GFP-Id1-2組及pCGSIL-GFP-Id1-3組比較,pCGSIL-GFP-Id1-4組的Id1蛋白表達水平最低(P<0.05),沉默效果最優。以pCGSIL-GFP-Id1-4干擾載體組建慢病毒后,測得慢病毒的病毒滴度為2.0×109 TU/mL。與空白對照組和陰性對照組比較,以組建的慢病毒感染人HepG2細胞后,人HepG2細胞中Id1 mRNA及其蛋白的表達水平均降低(P<0.05)。 結論本實驗構建的特異性慢病毒可穩定地介導Id1基因的沉默。

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